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液相色譜填料研究進展

 

一、        概述

色譜固定相一直被人們稱為色譜的“心臟”,在色譜分離中扮演著不可或缺的角色,色譜填料的發展情況密切關系著色譜技術的發展。

常用的色譜填料類型按基質不同可分為三類:無機基質、有機基質和有機-無機復合基質填料。無機基質填料機械強度高,在任何介質中均呈現不可壓縮性,且色譜柱柱效高,是色譜填料研究和應用的主流。硅膠以其柱效高、機械強度高,物理性質如粒徑分布、孔結構、比表面積易于控制,表面易改性等優點,是最主要的固定相基質。早期經典液相色譜填料通常是30-40µm、40-60µm或更大粒徑的不定形硅膠,這些硅膠由更大粒徑的硅膠研磨,再經過粒徑分級得到,柱效僅為1000/m;20世紀70年代后期,5-10µm不定形硅膠填料應用于液相色譜,柱效達到25000/m;年代至今,80年代至今,在分析型色譜柱領域,5-10µm球形硅膠填料逐漸取代無定形硅膠填料,柱效可達50000-80000/m;90年代初,亞2µm硅膠填料用于高效液相色譜的快速分離成為一種新的發展趨勢。

有機基質材料主要為有機聚合物和石墨碳,此類材料克服了硅膠基質填料不耐強酸強堿的缺點,化學穩定性好,pH值適用范圍寬,疏水保留性很強,近年來獲得飛速的發展。與相同粒度硅膠基質色譜柱相比,其主要缺點是柱效低,且在不同有機改性劑中溶脹程度不同,只能應用于單一有機改性劑的等度分離。有機-無機復合材料結合了無機材料的高效性、優良的機械強度以及有機材料的耐熱性、pH值使用范圍寬等特點,日益受到人們的重視。

多糖、蛋白、多肽等大分子化合物的分離純化是目前研究的熱點,分離困難,幾乎不太可能用單一方法純化。參考最近三年文獻,分離大多使用色譜法,使用中壓分離的比例極小。但目前分離填料越做越細,采用中高壓層析應是趨勢。從手頭已有資料來看,用于多糖、蛋白、多肽制備分離填料粒徑與反相硅膠相似,但由于其規定流速小于反相硅膠,所以同等內徑和長度的色譜柱流速和壓力均低于反相硅膠。蛋白質、多肽有多種分離方法,其中最常見的是反相色譜(RPC)、離子交換色譜(IEC)、體積排阻色譜(SEC)、疏水色譜(HIC)、親合色譜(AFC),根據蛋白質分子的大小形狀、特殊結構、電荷、疏水性等特征選用一種或幾種方法進行純化。

目前,商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售,填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數,即柱效和背壓。粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的填料應用,在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度,但不是 的因素。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選擇更小粒度的填料是很有用的,3um填料填充柱的柱數比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時,柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱,以縮短分析時間,另外,可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力。

一般來說,分析型色譜柱填料也可以用于制備型色譜柱中,但是制備色譜中使用的量大,而且需要反復裝柱,因此對于制備色譜填料有一些特殊的要求:(1)機械強度高;(2)負載量高,單位重量的填料負載量高可以處理更多的樣品;(3)可大量供應,批間的重現性好;(4)粒徑大小合適,分布范圍窄;(5)化學穩定性好,選擇性好,無毒,易于填充,價格合理等。

制備柱是否裝填均勻、結實,關系到色譜過程的分離效率,是柱技術中最關鍵的部分, 也是決定柱效高低的主要因素之一。目前,制備柱的裝柱方法主要有干裝法、勻漿法和壓縮法三種。干裝法是色譜柱在做上下抖動的同時,將柱填料加入柱子中。干裝法填裝的柱子柱床相對穩定,均勻,填充裝置簡單,成本低。此法適合于裝填顆粒度大于20~30μm的填料,而顆粒小于20μm的填料不宜用此法裝填,不易于填裝均勻。勻漿法又稱濕法,是用等密度溶劑作為勻漿劑,經超聲波處理,使填料在勻漿劑中高度分散制成勻漿,在高壓下,用頂替液將勻漿壓入柱內,制成具有均勻、緊密填充床的制備色譜柱。勻漿法現已成功用于柱徑不超過100mm的制備柱的裝填,而大柱徑制備柱的裝填不適合用此法,因為柱徑大,難以得到穩定的柱床。壓縮法主要有軸向壓縮法、徑向壓縮法和環形膨脹壓縮法,前兩種使用前述的相應設備即可實現。環形膨脹柱是通過柱中心的一個楔形桿推動活塞上下移動,產生擠壓柱床的徑向和軸向復合力,使柱填充緊密,目前還處于試驗階段。

二、        填料種類

如今填料種類繁多,常見的有硅膠填料、手性填料、離子交換色譜填料、聚合物填料和其他無機填料等。

1. 硅膠填料

硅膠填料主要應用正相色譜及反相色譜柱中,正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica),以及其他具有極性官能團,如胺基團(NH2、APS)和氰基團(CN、CPS)的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團的極性較強,因此,分離的次序是依據樣品中的各組份的極性大小,即極性強的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene  Chloride)等。

反相色譜填料常是以硅膠為基礎,表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強,通常為水,緩沖液與甲醇,已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出,而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

目前在制備色譜中,使用最多的就是硅膠及其衍生物的鍵合固定相(如C18 ) 填料。雖然硅膠及其衍生物使用的較多,但是它們也有其缺點,例如硅膠對極性物質(特別是對堿性溶質)產生非特異性吸附,導致峰嚴重拖尾。為了克服上述缺點,人們對高純硅膠及其鍵合固定相進行了潛心的開發,得到了金屬雜質含量極低的高純硅膠及其鍵合固定相。

超純硅膠微球的制備一般以正硅酸乙酯(TEOS)為硅源,采用噴霧干燥法、聚合誘導膠體聚集法(PICA)、一次催化溶膠-凝膠法、二次催化溶膠-凝膠法、模板法等方法制備。噴霧干燥法是在不融合的兩相條件下使硅酸鹽聚合生成溶膠,再將硅溶膠噴霧成形變為凝膠,然后在熱氣流或石蠟油等分散劑中固化得到最終的硅膠微球產品,這是目前催化劑等化工產品用硅膠的最主要制備方法之一。目前市場上平均孔徑在6-12nm,比表面積在300-500m2/g范圍的多孔硅膠 微球,如國產的YQG型、瑞典的Kromasil、德國的Nuclesil等均采用該方法制備。聚合誘導膠體聚集法又稱堆積硅珠法,是通過在硅溶膠分散體系中的聚合反應,將納米級硅溶膠包結成有機-無機復合微球,燒結除去有機物后得到全多孔硅膠微球,以該法生產的典型代表是美國Agilent公司生產的Zorbax硅膠。溶膠-凝膠法是制備硅膠微球的常用方法,通常在酸性或堿性條件下使硅源水解縮聚得到硅膠微球。模板法是在傳統溶膠凝膠體系中引入模板物質,在溶劑存在的條件下使模板劑對硅源進行引導,從而生成具有納米有序結構的介孔性硅膠。硅膠經表面改性可制得適用于不同分離模式的色譜填料,這種改性與修飾一般通過三種方法實現:表面的化學修飾、整體修飾和聚合物包覆。

2. 手性填料

物質與其鏡像不能疊合的現象被稱為手性(Chirality)。互為對映體的兩分子,僅在原子空間排列方式上存在著微小差異,除旋光性不同之外,其他理化性質二者完全相同,常常以外消旋體形式存在。這些手性異構體的存在是人類賴以生存的自然界的一種普遍現象,組成生命體系的大分子如蛋白質、核酸、多糖等都具有手性特征,它們影響著食品、藥品以及各種添加劑等手性物質在體內的運輸和代謝方式。

手性異構體的存在,在藥物化學領域顯得尤為突出。據權威統計,世界上心腦血管等重大疾病的治療藥物均屬高科技含量的合成藥,這些藥物結構中大多含有不對稱的碳原子,均屬于手性藥物范疇,在市場及臨床方面多以外消旋體的形式銷售和使用。藥物對映體通常具有不同的毒性作用、藥理功能和藥代動力學行為。因此,不當使用外消旋體藥物,可能導致錯誤的藥代動力學行為和作用模式,進而產生嚴重的影響。手性藥物以其作用靶點明確,見效快,成為了全世界治療重大疾病的療效藥物,是藥物界的一顆摧壤明星,故而也成為了科研人員研發的焦點。但由于發展太快,多數手性藥物還未建立系統有效的分析方法。建立和發展高效、快速、準確的藥物對映體分析方法對藥物的開發和臨床用藥指導具有重要意義。

手性填料的研發成為手性分離的重中之重。手性色譜柱是由具有光學活性的單體,固定在娃膠或其它聚合物上制成手性固定相。通過手性環境的引入使對映異構體間呈現物理特征的差異,從而達到光學異構體拆分的目的。要實現手性識別,手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用,即為“三點作用原理”。該原理認為:在手性分離中,要實現溶質化合物的有效拆分,溶質和固定相之間至少存在三點相互作用。這些作用可以是氧鍵作用、靜電作用、偶極-偶極作用、Л-Л作用、疏水作用或空間作用等,并且至少其中一點要有立體選擇性,即當用手性物質中的另一對映體來替代后,至少有一種作用力消失在或明顯改變性質。

目前國際上已經研制出約有1500多種手性填料,其中有200多種已商品化。為了簡單化,根據一種被廣泛采用的Wainer分類方法即基于CSP與被分析物之間相互作用機理不同分為Pirkle型手性填料、環糊精類手性填料、大環抗生素類手性填料、蛋白質類手性填料、配體交換型手性填料和纖維素類手性填料。

3. 離子交換色譜填料

離子交換色譜是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的待分離組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而將混合物進行分離的一種色譜方法。

離子交換色譜填料是由載體、配基 (離子官能團) 和反離子3部分組成。載體是惰性物質,在離子交換過程中不參與任何反應。配基結合在載體上,反離子通過靜電引力與配基相結合。如果配基是帶正電的基團,反離子就是帶負電,這種類型稱為陰離子交換劑,可以吸附帶負電的蛋白質。如果配基是帶負電的基團,那么反離子就是帶正電,稱為陽離子交換劑,可以吸附帶正電荷的蛋白質。

4. 聚合物填料

聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要優點是在PH值為1~14均可使用。相對與硅膠基質的C18填料,這類填料具有更強的疏水性;大孔的聚合物填料對蛋白質等樣品的分離非常有效。現在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料,色譜柱柱效較低。

5. 其他無機填料

由于其特殊的性質,一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基鍵合相,石墨化碳的表面即是保留的基礎,不再需其它的表面改性,該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強,石墨化碳可用于分離某些幾何導構體,又由于在液相色譜流動相中不會被溶解,這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于液相色譜,氧化鋁微粒剛性強,可制成穩定的色譜柱柱床,其優點是可在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強,應用范圍受到一定的限制,所以未能廣泛應用,新型氧化鋯填料也可用于液相色譜,商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,應用PH范圍1~14,溫度可達100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究,加之面臨的實驗難度,其重要用途與優勢尚在進行中。

三、        色譜填料發展方向

  一是研發小粒徑的色譜填料和發展整體柱,朝著快速、高效分離的方向發展。超高效液相色譜比高效液相色譜分析速度更快更靈敏,它通過性能優越的色譜柱,精確梯度控制的超高壓液相色譜泵,低擴散、低交叉污染的自動進樣系統及高速檢測器使超高效液相色譜的峰容量、分析效率、靈敏度較常規高效液相色譜有了很大的提高,為復雜體系的分離分析提供了良好的條件。

  二是應用雜化材料和具有高分離度的填料解決色譜柱分析分離中目前存在的一些問題,比如說一些極性很強的化合物的保留和分離的問題。

三是發展多維色譜的出現,二維液相色譜是近年來發展起來的一種高效分離技術,正交的二維系統在分辨率、峰容量方面比一維情況都有所增加,已成為復雜體系組分分離和分析的強有力工具,在生命科學研究中得到了廣泛的應用。但目前液相色譜的二維分析系統還有很多問題仍未解決,比如說二維體系分離中的正交性分離的問題。

近年來人們制備了大量的含有不同鍵合基團的色譜填料以增強色譜柱的選擇性,從而滿足實際樣品分離的需要,例如親水作用色譜(HILIC)填料、立體保護鍵合色譜填料、極性嵌入反相色譜填料、有機-無機雜化色譜填料、親水性體積排阻色譜填料、混合模式色譜填料、手性色譜填料以及聚合物基質色譜柱填料。

四、        填料廠家

近年來,為了適應科學的進步和工業技術的發展,制備色譜技術也取得了顯著進步,成為許多公司進行商業競爭的熱點。生產和供應制備色譜填料的廠家和公司很多,類型和規格也在不斷發展,主要廠家見附表。工業制備分離色譜柱一般為動態軸向壓縮柱(DAC)柱,目前生產DAC柱的廠商主要有法國的NovaSep(由以前的Prochrom和Novasep合并)、美國的MODcol、英國的Jones Chromatography和德國的Merck KGaA等公司。

附表:制備色譜填料廠家一覽表

生產廠家

填料類型

規格型號

YMC

雜化硅膠填料(YMC-Triart Prep)

硅膠類填料(YMC-Exphere C18;YMC*GEL HG;YMC*GEL;制備用不定型填料)

生物液相中試類填料(YMC-BioPro離子交換填料)

 

粒徑:10, 15, 20µm

PH值范圍:2~10

 

富士

Chromatorex產品系列:SPS SMBMB GS

 

粒徑:3,5,10,15,20和20 - 45µm

      曹(DAISO

C18(ODS)C8C4APS(氨基)、苯基、氰基、二醇

孔徑:60Å、100Å、120Å和200Å、300Å

     克(Merck

正相硅膠(Silica Gel 40;Silica Gel 60;Silica Gel 100)

反相C18硅膠(Silica Gel60)

 

粒徑:63-200μm;40-63μm

 

阿克蘇諾貝爾(Kromasil

SILC4C8C18NH2        Phenyl

 

粒徑:7μm;10μm;13μm;16μm

 

賽分科技

硅膠基質填料(球形硅膠基質填料;不定形硅膠基質填料)

聚合物基質填料(Generik MC離子交換填料;PolyRP反相層析填料;Generik 離子交換填料;Proteomix 離子交換填料;MabPurix™親和填料;Agarosix FF離子交換填料)

粒徑:5μm;10μm;15μm;20μm;20-40μm;40-60μm;

迪馬

Inspire(SIL;C4;C8;C18;C18-EP;Diol)

粒徑:10μm

 

疏水色譜填料(Hexyl;Butyl)

反相色譜填料(200Å填料;300Å填料)

粒徑:5μm;10μm;15μm;20μm;40μm;50μm

蘇州納微生物科技

單分散聚合物色譜填料

硅膠色譜填料

反相聚合物色譜填料

離子交換色譜填料

疏水色譜填料

親和層析填料

凝膠滲透色譜

萬古霉素專用色譜填料

富勒烯專用色譜填料

甜菊糖專用色譜填料

固相萃取填料

粒徑:5μm;10μm;15μm;20μm;30μm;40μm;50μm

濟南博納生物技術有限公司

硅膠色譜填料( 正相色譜填料;反相硅膠填料)

聚合物色譜填料

固相萃取填料

瓊脂糖凝膠填料

粒徑:5μm;10μm;15μm;20μm;30μm;40μm;50μm

月旭

Ultimate®色譜填料

XtimateTM色譜填料

Welchrom®色譜填料

孔徑:120 Å、200Å、300Å

博納艾杰爾

正相色譜填料

C4C8C18 等反相鍵合填料

HILIC親水鍵合填料

氧化鋁(中性/酸性/堿性)

離子交換樹脂

 

格雷斯(Grace

Vydac 150HC多肽填料

 

研創手性

手性填料(SDMP;MDMP;MCDP;SCDP;IC;IB;IA;AS;AD;OA;OD;OJ

粒徑:10μm;20μm

常州嘉眾新材料科技有限公司

Outstanding 卓越系列

Cleaning-P 樹脂基系列填料

 

粒徑:30μm;60μm

孔徑:60~300 Å

蘇州知益微球科技有限公司

聚合物反相色譜填料

凝膠滲透色譜

 

粒徑:15μm;20μm;25μm;;30μm

 

 

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